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论著
东北5家医院碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药基因的分析
中华传染病杂志, 2017,35(06): 357-363. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.008
摘要
目的

了解东北地区5家医院临床分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌(CRE)的药物敏感情况和碳青霉烯酶耐药基因。

方法

收集2013年1月至2015年6月东北地区5家医院临床分离的85株CRE菌株,采用微量肉汤稀释法测定受试菌株对14种抗菌药物的敏感度。分别通过改良Hodge试验、EDTA协同试验进行碳青霉烯酶的表型检测,应用PCR基因扩增技术及DNA测序方法对受试菌株进行碳青霉烯酶基因型和超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因型进行检测,同时以PCR检测结果为金标准比较两种碳青霉烯酶检测方法。

结果

85株CRE中,肺炎克雷伯菌61株,占71.8%。药物敏感试验结果显示,对头孢菌素及β-内酰胺/酶抑制剂复合制剂(哌拉西林他唑巴坦)的耐药率均>80.0%,对碳青霉烯类抗菌药物厄他培南耐药率为100.0%(85/85),对美罗培南和亚胺培南的耐药率分别为65.9%(56/85)和71.8%(61/85),有36株菌对两者同时耐药;对喹诺酮类药物耐药率分别为左氧氟沙星72.9%(62/85),环丙沙星65.9%(56/85);对磷霉素和阿米卡星的耐药率分别为65.0%(55/85)和54.1%(46/85);耐药率最低的是多黏菌素和替加环素,分别为21.2%(18/85)和20.0%(17/85)。改良Hodge试验和EDTA协同试验阳性菌株分别为49、12株。经PCR检出64株产碳青霉烯酶基因,分别为KPC-2(53/85,62.4%)、IMP-4(10/85,11.8%)、NDM-5(7/85,8.2%)、NDM-6(1/85,1.2%)。同时对85株CRE菌株进行了ESBL基因检测,未检测出TEM型及SHV型酶,产CTX-M型ESBL酶的菌株有47株(55.3%)。

结论

东北5家医院临床分离的CRE以肺炎克雷伯菌为主,对大多数抗菌药物耐药。CRE株以产KPC-2型碳青霉烯酶为主,约50%菌株同时携带碳青霉烯酶基因和ESBL酶基因,耐药机制复杂。

引用本文: 吴娜, 田素飞, 褚云卓, 等.  东北5家医院碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药基因的分析 [J]. 中华传染病杂志,2017,35( 6 ): 357-363. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.008
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目前,碳青霉烯类耐药肠杆菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae,CRE)呈现广泛蔓延的趋势,由于抗菌药物的使用受到药物供应、用药习惯以及用药水平的影响,细菌的耐药特征往往具有地域差异,因此了解东北地区CRE菌株碳青霉烯酶基因及超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因的流行情况很有必要。

材料与方法
一、材料
1.菌株来源:

收集2013年1月至2015年6月东北地区5家医院CRE菌85株,其中中国医科大学附属第一医院45株,中国医科大学附属盛京医院10株,辽宁省人民医院12株,大连市医科大学附属第一医院10株,哈尔滨医科大学附属第一医院8株,均为非重复菌株,对亚胺培南或美罗培南耐药。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218、铜绿假单胞菌ATCC27853。

2.仪器与试剂:

PCR仪为美国Applied Biosystems公司产品,水平电泳仪为美国Bio-Rad公司产品,Mueller-Hinton MH琼脂、美罗培南纸片为英国Oxoid公司产品,EDTA为北京市普利莱基因技术有限公司产品,小量DNA抽提纯化试剂盒、DNA标志物、2×Taq PCR MasterMix均购自北京天根生化科技有限公司,EB替代物为北京市普利莱基因技术有限公司提供,PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

二、药物敏感试验

将抗菌药物溶解倍比稀释成系列浓度。制备菌悬液,用MH肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准[1×108菌落形成单位(CFU)/mL],应用MH肉汤将菌悬液1∶100倍稀释成1×106CFU/mL。微量肉汤稀释,取96孔板沿纵轴分别加入相同稀释浓度的抗菌药物0.1 mL,沿横轴取接种浓度1×106CFU/mL的同种菌悬液第1至第10孔分别加入0.1 mL。横轴第11孔作为细菌生长阳性对照(加入0.1 mL培养基和0.1 mL菌悬液),第12孔作为不含菌液的阴性对照(加入0.2 mL培养基)。震荡混匀,37 ℃培养过夜。

结果判读:若生长对照孔细菌生长良好、质控菌株的最低抑菌浓度(MIC)在标准范围内,无菌生长孔的最低浓度为该药对该株细菌的MIC值,MIC结果根据临床实验室标准化研究所2014年标准、欧洲药物敏感试验委员会2012年折点标准判读。

三、改良Hodge试验

1∶10稀释0.5麦氏单位的大肠埃希菌(ATCC25922)均匀涂布于琼脂平皿,将10 μg/片的美罗培南纸片贴放于平皿中央。接种环挑取3~5个过夜生长待测菌落,垂直于美罗培南纸片从纸片边缘向外划直线,长度20~25 mm。35℃温育16~20 h。在被测菌株与大肠埃希菌(ATCC25922)抑菌圈交汇处大肠埃希菌生长增强者为产碳青霉烯酶阳性。

四、EDTA协同试验

参照文献[1, 2]制备EDTA药物敏感纸片,取10 μL浓度为0.5 mol/L的EDTA加到空白纸片,无菌晾干备用。将0.5麦氏单位待测菌悬液均匀涂布于MH琼脂培养基,美罗培南纸片置于琼脂平板表面,距其1 cm处贴EDTA纸片,35 ℃过夜培养。美罗培南抑菌圈靠近EDTA纸片侧出现明显扩大者,判断为阳性菌株。

五、PCR检测碳青霉烯类耐药基因
1.DNA模版制作:

从血琼脂培养皿挑取单个受试菌落加入5 mL的LB肉汤培养液,恒温振荡培养18~20 h,取4 mL菌液。其余步骤参照DNA提取试剂盒说明书。

2.PCR扩增目的基因:

PCR扩增引物序列见表1,由上海生工生物技术有限公司合成。PCR体系:取基因组DNA模板5 μL,加入引物1(0.5 μL)、引物2(0.5 μL),2×Taq PCR masterMix 12.5 μL,加无菌纯水至25 μL。PCR条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,61 ℃ 30 s, 72℃ 30 s,30个循环;72 ℃ 10 min。

表1

碳青霉烯酶基因引物序列

表1

碳青霉烯酶基因引物序列

基因型引物序列5′→3′片段长度(bp)参考文献
KPC正向:AGGACTTTGGCGGCTCCAT749[3]
 反向:TCCCTCGAGCGCGAGTCTA  
GES正向:GTTTTGCAATGTGCTCAACG371[4]
 反向:TGCCATAGCAATAGGCGTAG  
SME正向:AGATAGTAAATTTTATAG1 138[4]
 反向:CTCTAACGCTAATAG  
IMI正向:ATAGCCATCTTGTTTAGCTC818[5]
 反向:TCTGCGATTACTTTATCCTC  
IMP正向:CTACCGCAGCAGAGTCTTTG587[6]
 反向:AACCAGTTTTGCCTTACCAT  
NDM正向:CTCGCACCGAATGTCTGGC386[7]
 反向:CATTGGCGGCGAAAGTCA  
VIM-2正向:AAAGTTATGCCGCACTCACC865[8]
 反向:TGCAACTTCATGTTATGCCG  
OXA-48正向:TTGGTGGCATCGATTATCGG744[4]
 反向:GAGCACTTCTTTTGTGATGGC  
3.PCR产物纯化及测序:

PCR产物由上海生工生物技术有限公司进行纯化及双向测序。测序得到的基因片段拼接为完整基因,继而采用Bioedit软件进行序列比对和网上相似性检索分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。

六、比较两种碳青霉烯酶表型检测方法

以PCR检测结果为金标准,分别计算改良Hodge试验和EDTA协同试验检测碳青霉烯酶的假阳性率、假阴性率、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。

七、PCR检测ESBL基因

PCR检测TEM、SHV、CTX-M等各型ESBL基因,PCR扩增引物序列见表2,委托上海生工生物技术有限公司合成,反应体系及条件同上。

表2

超广谱β-内酰胺酶基因引物序列

表2

超广谱β-内酰胺酶基因引物序列

基因型引物序列5′→3′片段长度(bp)参考文献
SHV正向:GGGTTATTCTTATTTGTCGC928[9]
 反向:TTAGCGTTGCCAGTGCTC  
TEM正向:ATGAGTATTCAACATTTTCGT860[10]
 反向:TTACCAATGCTTAATCAGTGAG  
CTX-M-1组正向:GGCCCATGGTTAAAAAATCACTGC891[9]
 反向:CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTTG  
CTX-M-2组正向:CATTCGCCGCTCAATGTTA861[9]
 反向:CAGAAACCGTGGGTTACGAT  
CTX-M-8组正向:ACTTCAGCCACACGGATTCA948[9]
 反向:AAGTGGAGCGACAGAGC  
CTX-M-9组正向:GAGAGTGCAACGGATGATGT850[9]
 反向:GATGATTCTCGCCGCTGAAG  
结果
一、CRE的耐药性

85株CRE中,肺炎克雷伯菌61株,占71.8%。85株CRE对头孢菌素及β-内酰胺酶抑制剂复合制剂(哌拉西林他唑巴坦)的耐药率均>80.0%,有36株CRE对美罗培南和亚胺培南同时耐药,CRE对多黏菌素和替加环素耐药率最低。见表3。中国医科大学附属第一医院的45株CRE中,2013年、2014年、2015年的美罗培南MIC90分别为1 mg/L、256 mg/L、>512 mg/L,3年间呈逐渐增加趋势。

表3

85株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌对14种抗菌药物的耐药性和MIC

表3

85株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌对14种抗菌药物的耐药性和MIC

抗菌药物耐药[株,率(%)]敏感率[株,率(%)]MIC50(mg/L)MIC90(mg/L)
头孢噻肟85(100.0)0(0)512>512
厄他培南85(100.0)0(0)64512
头孢曲松83(97.6)2(2.4)256>512
哌拉西林他唑巴坦73(85.9)6(8.0)512>512
头孢他啶72(84.7)11(12.9)256>512
头孢吡肟56(65.9)18(21.2)256>512
左氧氟沙星62(72.9)16(18.8)128512
环丙沙星56(65.9)13(15.3)128512
磷霉素55(65.0)30(35.0)64256
阿米卡星46(54.1)39(45.9)256>512
亚胺培南61(71.8)20(23.5)64>512
美罗培南56(65.9)23(27.1)64512
多黏菌素18(21.2)67(78.8)14
替加环素17(20.0)37(43.5)24

注:MIC为最低抑菌浓度

二、改良Hodge试验

改良Hodge试验检测碳青霉烯酶结果见图1。85株临床分离菌株中49株菌改良Hodge试验阳性,其中40株肺炎克雷伯菌、3株大肠埃希菌、2株弗劳地柠檬酸杆菌、1株阴沟肠杆菌、1株奇异变形杆菌、1株产酸克雷伯菌、1株摩根摩根菌。

图1
改良Hodge试验检测碳青霉烯酶结果

注:1.改良Hodge试验结果阳性;2.选取肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705为阳性对照;3.改良Hodge试验结果阴性;4.选取肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706为阴性对照

图1
改良Hodge试验检测碳青霉烯酶结果
三、EDTA协
同试验

EDTA协同试验阳性结果见图2。实验中12株阳性,其余为阴性。

图2
乙二胺四乙酸协同试验阳性结果和阴性结果

注:M为美罗培南药敏纸片;E为乙二胺四乙酸纸片。美罗培南抑菌圈靠近乙二胺四乙酸纸片侧出现明显扩大者,判断为阳性菌株

图2
乙二胺四乙酸协同试验阳性结果和阴性结果
四、PCR检测碳青霉烯类耐药基因

经PCR检测和DNA测序,85株临床分离菌株中,共检出64株产碳青霉烯酶基因。结合第一部分药敏实验结果,碳青霉烯酶检测阳性组的美罗培南MIC50为128 mg/L、MIC90为512 mg/L,是碳青霉烯酶阴性组的512倍和8倍,两组耐药率差异有统计学意义(79.7%比23.8%,P<0.01)。亚胺培南对碳青霉烯酶阳性组菌株的MIC50、MIC90也比碳青霉烯酶阴性组高,但是两组间耐药率差异无统计学意义(P=0.25),见表4

表4

碳青霉烯酶阳性和阴性菌株对碳青霉烯类抗菌药物药敏情况

表4

碳青霉烯酶阳性和阴性菌株对碳青霉烯类抗菌药物药敏情况

碳青霉烯酶菌株数美罗培南亚胺培南
S(%)R(%)MIC50(mg/L)MIC90(mg/L)S(%)R(%)MIC50(mg/L)MIC90(mg/L)
阳性648(12.5)51(79.7)12851215(23.4)47(73.4)128>512
阴性2115(71.4)5(23.8)0.25645(23.8)12(57.1)4>512

注:S为敏感;R为耐药;MIC为最低抑菌浓度

产KPC型碳青霉烯酶有53株,占62.4%,均为KPC-2型。产金属酶包括:IMP型酶基因有10株,占11.8%,均为IMP-4型酶基因。产NDM型酶基因有8株,分别为NDM-5型7株、NDM-6型1株。所有CRE菌株中GES、SME、IMI、VIM-2、OXA-48碳青霉烯酶基因检测均为阴性。

五、两种碳青霉烯酶表型检测方法的比较

以PCR检测结果为金标准,改良Hodge试验检测85株CRE中产碳青霉烯酶的灵敏度为83.0%(44/53)、特异度为84.4%(27/32),假阳性率为15.6%(5/32)、假阴性率为17%(9/53),阳性预测值为90%、阴性预测值为75%。EDTA协同试验的灵敏度为55.6%(10/18)、特异度为97.0%(65/67),假阳性率为3%(2/67)、假阴性率为44.4%(8/18),阳性预测值为83.3%、阴性预测值为89%。

六、ESBL检测结果

采用PCR和DNA测序分析同时对85株CRE进行了ESBL基因检测,未检测出TEM型及SHV型,产CTX-M型ESBL菌株有47株,占55.3%;经DNA测序结果显示,CTX-M-1组37株,分别为CTX-M-22型31株,CTX-M-28型5株,CTX-M-79型1株;CTX-M-9组21株,分别为CTX-M-14型13株,CTX-M-27型2株,CTX-M-65型6株;有11株同时产两种类型的酶。药物敏感试验发现,38株ESBL阴性菌株对美罗培南的耐药率高于ESBL阳性菌株(ESBL=0.022),对亚胺培南耐药率阴性菌和阳性菌间无差异,结果见表5。结合碳青霉烯酶的检测,共有35株菌同时产碳青霉烯酶和ESBL,其中KPC合并CTX-M-1组最多为14株,其次为IMP合并CTX-M-9组5株。

表5

ESBL阳性和阴性菌株对美罗培南、亚胺培南的药物敏感情况(株)

表5

ESBL阳性和阴性菌株对美罗培南、亚胺培南的药物敏感情况(株)

抗菌药物ESBL阳性ESBL阴性
美罗培南  
 敏感176
 中介42
 耐药2630
亚胺培南  
 敏感812
 中介60
 耐药3326

注:ESBL为超广谱β-内酰胺酶

讨论

β-内酰胺类是治疗肠杆菌科细菌感染有效的抗菌药物,但随着产β-内酰胺酶肠杆菌科细菌的广泛出现,其抗感染治疗作用明显下降。研究发现,头孢菌素等β-内酰胺类抗菌药物对肠杆菌科细菌存在不同程度的接种效应,提示即使体外药物敏感试验结果很好也不推荐临床应用[11]。碳青霉烯类药物由于其对ESBL和Ampc酶的稳定性,一直是临床针对革兰阴性杆菌感染的首选药物。美国全球细菌耐药监测显示,1998年至2004年尚未出现对碳青霉烯类耐药菌株的报道[12]。2005年以后,肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的耐药现象在美国、希腊、澳大利亚等多个国家和地区陆续报道,且耐药率逐年增多[13,14]。中国细菌耐药监测网(CHINET)的数据也提示,2005年至2010年临床CRE菌株的分离率提升了8%[15],主要集中在江浙地区,这可能与经济水平、医疗水平较高及抗菌药物的使用有关。

本研究收集2013年至2015年东北地区5家医院临床分离的CRE菌株中,以肺炎克雷伯菌为主,与文献报道结果一致[16,17]。CRE菌株常表现出对多种抗菌药物的多重耐药,本研究结果显示,受试菌株对厄他培南全部耐药,对美罗培南和亚胺培南的敏感率分别为27.1%和23.5%,对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为71.8%和65.9%,与文献报道结果一致[18,19],可能与美罗培南和青霉素结合蛋白(PBP)的高亲和力有关[20]。相对于β-内酰胺类,仍有少部分菌株对阿米卡星、磷霉素、喹诺酮类敏感,在一些文献中也提到了这些药物可以考虑作为联合用药的选择[2,14,21,22]

多数研究显示,多黏菌素和替加环素对CRE有较好的体外抗菌活性[17,21,22],经常作为治疗的推荐方案。虽然本实验中耐药率最低的是多黏菌素和替加环素,但也接近20%,高于目前国内其他地区的研究数据[15,23]。另外,多黏菌素由于其严重的肾毒性给临床应用带来了一定的局限性。替加环素作为新上市的有效抗菌药物为临床治疗耐药菌感染带来希望,但本实验发现对替加环素的耐药率为20.0%,同时受药物组织浓度的限制,临床不推荐替加环素用于血流感染和尿路感染[24,25]。由此可见,东北地区CRE的耐药性与其他地区相比存在一定的地域差异,耐药形势严峻,临床可以选择的药物有限。

产生碳青霉烯酶是造成肠杆菌科细菌对碳青霉烯类高耐药的主要机制。本研究发现,碳青霉烯酶阳性菌株中美罗培南、亚胺培南的MIC明显高于碳青霉烯酶阴性菌,阳性菌和阴性菌对美罗培南的耐药率差异有统计学意义,表现出产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌对临床常用碳青霉烯类抗菌药物高度耐药的特征。

2009年临床实验室标准化研究所推荐改良Hodge试验可用于碳青霉烯酶表型检测[26],比金标准的分子学方法简单易行。本研究结果显示,以PCR为标准,改良Hodge试验对CRE菌株中碳青霉烯酶的检出灵敏度和特异度分别为83.0%、84.4%,假阳性率为15.6%。有学者报道当细菌产ESBL和(或)AmpC酶合并外膜孔蛋白缺失时,可能会导致改良Hodge试验出现假阳性结果[27]。本研究中5株假阳性菌中有3株同时产CTX-M型ESBL。改良Hodge试验主要是针对KPC介导的碳青霉烯类耐药菌株,具有较高的敏感度及特异度,本实验中针对18株产金属酶的菌株EDTA协同试验的灵敏度和特异度分别为55.6%和97.0%,特异度高但是灵敏度偏低,试验存在一定的假阴性率,可能与合并产KPC酶有关。改良Hodge试验的阳性预测值比阴性预测值高,提示改良Hodge试验的阳性结果诊断价值较高,EDTA协同试验的阴性预测值比阳性预测值高。

迄今为止,文献报道的KPC有十余种亚型,以KPC-2和KPC-3最为常见[28]。在本研究中,KPC检出率为62.4%,略低于文献报道[23,29],但涉及的菌种分布广泛,包括肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌6种。经DNA测序均为KPC-2型,与国内其他地区流行的KPC亚型一致[3,23,29]

目前IMP介导的金属酶总共检出39型IMP。但是我国产IMP金属酶肠杆菌科细菌的报道较少,仅在广州、上海有个别报道[30,31],其中以IMP-4型为主要基因型。本实验检出金属酶IMP型酶基因10株,3株分离自中国医科大学附属盛京医院,7株分离自哈尔滨医科大学附属第一医院,经DNA测序全部为IMP-4。

目前,产NDM酶细菌已在世界多个国家地区被陆续分离和报道,多数为NDM-1型[32,33]。本研究发现,产NDM型酶基因有8株,与文献报道不同的是,经测序本次检出的7株NDM阳性菌株中有6株为NDM-6,1株为NDM-5基因。

相对于单独携带一种耐药基因,同时携带多种类别的耐药基因会使耐药谱增大,危害性更大。本研究中有35株菌同时产碳青霉烯酶和ESBL,其中KPC酶合并CTX-M-1组ESBL菌株数最多,其次为IMP酶合并CTX-M-9组,相关研究发现碳青霉烯酶类、超广谱β-内酰胺类的耐药基因可通过质粒传播。研究同时发现ESBL阴性CRE菌株对美罗培南耐药率反而高于ESBL阳性菌株,提示这些菌株中可能存在其他复杂的耐药机制。

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主题词
肠杆菌科
碳青霉烯酶
超广谱β-内酰胺酶