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论著
碱性亮氨酸拉链ATF样蛋白调控结核免疫发病机制的初步研究
中华传染病杂志, 2017,35(06): 321-325. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.001
摘要
目的

探讨碱性亮氨酸拉链ATF样蛋白(BATF)在结核中的免疫调控作用和机制,为结核的诊断和治疗提供线索。

方法

纳入16例活动性肺结核患者,10例潜伏性结核感染者和14名健康对照者。应用流式细胞术检测3组人群外周血T淋巴细胞BATF和程序性死亡受体-1(PD-1)的表达,分别用PD-1、PD-L1和PD-L2特异性抗体阻断PD-1/程序性死亡受体配体(PD-L)通路,检测活动性肺结核患者外周血中BATF表达的变化。两组之间比较采用Mann-Whitney U检验,Pearson相关性分析研究表达BATF的T淋巴细胞比例和表达PD-1的T淋巴细胞比例之间的关系。

结果

活动性结核组表达BATF的CD4 T淋巴细胞占CD4 T淋巴细胞的5.16%(2.96%,8.71%),高于潜伏性结核感染组的1.05%(0.40%,1.27%)和健康对照组的0.71%(0.43%,1.21%),差异均有统计学意义(U值分别为6.5和9.0,均P<0.01);活动性结核组表达BATF的CD8 T淋巴细胞占CD8 T淋巴细胞的4.10%(2.27%,8.17%),高于潜伏性结核感染组的0.55%(0.34%,1.18%)和健康对照组的0.84%(0.41%,1.29%),差异均有统计学意义(U值分别为5.0和8.0,均P<0.01)。活动性结核组BATF PD-1 CD4 T淋巴细胞占CD4 T淋巴细胞的比例均高于潜伏性结核感染组和健康对照组,差异均有统计学意义(U值分别为16.0和14.5,均P<0.01);且BATF PD-1 CD8 T淋巴细胞占CD8 T细胞的比例也均高于潜伏性结核感组和健康对照组,差异均有统计学意义(U值分别为10.0和16.5,均P<0.01)。活动性结核患者外周血中表达BATF的CD4 T淋巴细胞比例与表达PD-1的CD4 T淋巴细胞比例呈正相关(r=0.676,P=0.016),与CD8 T淋巴细胞比例亦呈正相关(r=0.610,P=0.035)。阻断活动性结核患者PD-1/PD-L通路后BATF在CD4和CD8 T淋巴细胞中的表达有所下降。

结论

BATF可能是PD-1/PD-L通路参与结核免疫负性调控的重要分子,进一步研究其在结核中的作用机制,可以对研究以BATF为靶点的新型抗结核免疫治疗提供理论依据。

引用本文: 刘倩倩, 欧勤芳, 高岩, 等.  碱性亮氨酸拉链ATF样蛋白调控结核免疫发病机制的初步研究 [J]. 中华传染病杂志,2017,35( 6 ): 321-325. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.001
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结核病目前在慢性感染中仍然饱受关注,机体感染结核分枝杆菌后的免疫反应决定了疾病的进展,活动性结核患者中Th1免疫反应的下调,导致体内结核分枝杆菌不能被清除,程序性死亡受体-1(programmed death,PD-1)/程序性死亡受体配体(programmed death ligand,PD-L)通路在负性调控结核免疫中发挥重要作用[1,2]。但关于PD-1负性调控结核免疫的机制一直在探索中,HIV感染的研究中报道,PD-1可通过上调碱性亮氨酸拉链ATF样蛋白(basic leucine zipper ATF-like transcription factor,BATF)表达抑制T淋巴细胞功能[3]。本研究通过流式细胞仪检测3种不同结核感染状态人群外周血T淋巴细胞中BATF的表达,探讨BATF在结核中的免疫调控机制,为结核的诊断和治疗提供线索。

对象与方法
一、研究对象

2015年9月至12月无锡市第五人民医院因活动性肺结核住院治疗的患者16例,同时在复旦大学附属华山医院的医务工作者中招募潜伏性结核感染者10例和健康对照者14名。入选对象年龄均>18岁,HIV抗体检测阴性,排除肿瘤、自身免疫性疾病、糖尿病和HBV、HCV等慢性感染,并签署知情同意书。活动性肺结核患者入选标准为痰抗酸杆菌涂片和(或)结核分枝杆菌培养阳性,入选时未接受抗结核治疗或抗结核治疗不超过2周,未接受免疫抑制剂治疗。

二、研究方法
1.采集标本:

入选对象均使用EDTA抗凝真空采血管采集外周血10 mL,4 h内进行标本处理。用Ficoll密度梯度分离法分离PBMC,并用自动细胞计数仪进行计数。

2.流式细胞术检测:

每个样本取1×106个PBMC至5 mL流式管中,同时设置单染管和空白对照管,每管加入2 mL 2% FBS-PBS洗2遍,加入相应的荧光抗体进行细胞表面染色,如CD4-太平洋蓝(PB)2.5 μL、CD8-藻红蛋白偶联物(PE-cy7)1 μL、PD-1-FITC5 μL(美国BD biosciences公司),充分混匀,避光温育10 min,2 mL 2%FBS-PBS洗涤2次,细胞打孔破膜,再加入BATF-别藻青蛋白(APC,美国RD systems公司)10 μL进行细胞内染色,4 ℃避光温育45 min。染色后的样品用体积分数为0.02的甲醛固定,FACSAria流式细胞仪(美国BD公司)检测,数据采用FlowJo10.0.7软件分析。

3.阻断PD-1/PD-L通路:

1×106个PBMC根据分组情况分别先加入PD-1抗体(工作浓度10 mg/L),PD-L1抗体(工作浓度10 mg/L)或PD-L2抗体(工作浓度10 mg/L)阻断1 h,再加入结核菌素纯蛋白衍生物(PPD,工作浓度25 mg/L)刺激16~20 h,转4 ℃冰箱终止,再进行流式细胞术检测。

三、统计学分析

采用GraphPad prism 6.0软件进行数据分析作图。非正态分布资料以M(P25P75)表示,两组之间比较采用Mann-Whitney U检验。Pearson相关性分析研究表达BATF的T淋巴细胞比例和表达PD-1的T淋巴细胞比例之间的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、一般情况

共纳入40例研究对象,其中16例活动性肺结核患者均为确诊病例,痰抗酸杆菌涂片和(或)结核分枝杆菌培养阳性率100%,其中6例入选时未接受抗结核治疗,10例接受抗结核治疗中位时间5.5 d。10例潜伏性结核感染者均为γ干扰素释放试验(IGRA)检测阳性,且无活动性结核感染证据。14名健康对照者IGRA检测均为阴性,且无活动性结核感染证据。见表1

表1

研究对象的一般情况

表1

研究对象的一般情况

组别例数性别(例)年龄[岁,中位数(P25P75)]卡介苗接种史[例(%)]活动性结核接触史[例(%)]痰抗酸杆菌涂片或培养阳性[例(%)]
HC组1441034.5(28.8,36.0)14(100)00(0)
LTBI组105533.0(29.5,36.3)10(100)1(10)0(0)
ATB组1610639.5(18.0~47.8)14(100)016(100)

注:HC为健康对照;LTBI为潜伏性结核感染;ATB为活动性结核

二、BATF在不同结核感染状态人群外周血T淋巴细胞中的表达情况

活动性结核组表达BATF的CD4 T淋巴细胞占CD4 T淋巴细胞的5.16%(2.96%,8.71%),高于潜伏性结核感染组的1.05%(0.40%,1.27%)和健康对照组的0.71%(0.43%,1.21%),差异均有统计学意义(U值分别为6.5和9.0,均P<0.01),见图1。活动性结核组表达BATF的CD8 T淋巴细胞占CD8 T淋巴细胞的4.10%(2.27%,8.17%),高于潜伏性结核感染组的0.55%(0.34%,1.18%)和健康对照组的0.84%(0.41%,1.29%),差异均有统计学意义(U值分别为5.0和8.0,均P<0.01)。而两者在潜伏性结核感染组和健康对照组中比较差异无统计学意义(U值分别为60.0和49.0,均P>0.05)。

图1
不同结核感染状态人群BATF在外周血CD4 T淋巴中表达的流式细胞图

注:BATF为碱性亮氨酸拉链ATF样蛋白。A.健康对照组;B.潜伏性结核感染组;C.活动性结核组

图1
不同结核感染状态人群BATF在外周血CD4 T淋巴中表达的流式细胞图

进一步分析在不同结核感染状态人群中BATF PD-1 T淋巴细胞所占的比例,发现活动性结核组BATF PD-1 CD4 T淋巴细胞占CD4 T淋巴细胞的0.38%(0.17%,0.57%),高于潜伏性结核感染组的0.06%(0.04%,0.199%)和健康对照组的0.07%(0.05%,0.09%),差异均有统计学意义(U值分别为16.0和14.5,均P<0.01);且BATF PD-1 CD8 T淋巴细胞占CD8 T细胞的中位数为0.30%(0.15%,0.59%),也高于潜伏性结核感组的0.04%(0.02%,0.09%)和健康对照组的0.07%(0.02%,0.11%),差异均有统计学意义(U值分别为10.0和16.5,均P<0.01)。潜伏性结核感染组和健康对照组相比,BATF PD-1 T淋巴细胞所占的比例无论在CD4还是在CD8 T淋巴细胞中差异均无统计学意义(U值分别为48.0和41.0,均P>0.05)。

三、活动性结核患者外周血CD4和CD8 T淋巴细胞中BATF的表达与PD-1表达之间的相关性

16例活动性肺结核患者中有12例检测了其外周血PD-1表达情况。结果显示,表达BATF的CD4 T淋巴细胞比例与表达PD-1的CD4 T淋巴细胞比例呈正相关(r=0.676,P=0.016),且表达BATF的CD8T淋巴细胞比例和表达PD-1的CD8T淋巴细胞比例亦显著正相关(r=0.610,P=0.035)。见图2

图2
12例活动性结核患者外周血T淋巴细胞中BATF的表达与PD-1表达的相关性

注:A.活动性结核患者外周血中表达BATF的CD4 T淋巴细胞比例和表达PD-1的CD4 T淋巴细胞比例的相关性;B.活动性结核患者外周血中表达BATF的CD8 T淋巴细胞比例和表达PD-1的CD8 T淋巴细胞比例的相关性。BATF为碱性亮氨酸拉链ATF样蛋白;PD-1为程序性死亡受体-1

图2
12例活动性结核患者外周血T淋巴细胞中BATF的表达与PD-1表达的相关性
四、阻断PD-1/PD-L通路对活动性结核患者T淋巴细胞内BATF表达的影响

阻断PD-1时活动性结核患者表达BATF的CD8 T淋巴细胞占CD8 T淋巴细胞的比例低于PPD刺激组,差异有统计学意义[0.82%(0.52%,1.02%)比1.51%(1.02%,3.52%),U=5.0,P<0.05],而表达BATF的CD4 T淋巴细胞比例与PPD组比较差异无统计学意义[1.06%(0.44%,1.55%)比2.91%(0.98%,4.627%),U=7.0,P>0.05]。阻断PD-1的配体PD-L1/PD-L2时,活动性结核患者表达BATF的CD4 T淋巴细胞占CD4 T淋巴细胞的比例[0.64%(0.29%,1.24%)比2.91%(0.98%, 4.62%), U=4.0, P<0.05]以及表达BATF的CD8 T淋巴细胞占CD8 T淋巴细胞的比例[0.50%(0.39%,1.18%)比1.51%(1.02%,3.52%),U=5.0,P<0.05]较PPD刺激组减少,差异均有统计学意义。

讨论

结核分枝杆菌是胞内病原菌,人体感染后的免疫应答模式以T淋巴细胞介导的细胞免疫为主。T淋巴细胞的激活除了需要抗原提呈细胞(APC)加工提呈的抗原作为第一信号,还需要协同刺激分子相互作用,如CD28、CTLA-4、PD-1与其配体结合,提供第二信号。PD-1是CD28家族成员,与其配体PD-L结合介导负性调节信号[4]。前期研究发现,PD-1及其配体PD-L1、PD-L2在活动性结核患者外周血免疫细胞表面表达显著高于健康对照者,通过阻断PD-1/PD-L通路可增强结核特异性CD4 T细胞分泌γ干扰素和IL-2的能力、增殖能力以及杀结核分枝杆菌的能力[5,6]

Quigley等[3]在HIV感染的研究中发现,PD-1除了可以抑制T淋巴细胞受体(T cell receptor,TCR)信号的传导,还可以通过上调CD8 T淋巴细胞BATF的表达抑制T淋巴细胞的功能。BATF是活化蛋白转录因子激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)家族成员,与AP-1具有相似的结构,由Jun和Fos亚单位构成,但不具备传统转录因子活化区域,目前已知Jun/Fos异二聚体在细胞增殖中起正向调节作用,而BATF通过与Fos竞争性结合Jun,形成Jun/BATF异二聚体,代替Jun/Fos异二聚体和DNA结合,从而抑制转录因子活化信号的传递,负性调控AP-1介导的功能[7]。BATF家族包括BATF、BATF2和BATF3,BATF和BATF3主要参与DC、T淋巴细胞和B淋巴细胞的免疫调控[8,9,10],耗竭的CD8 T淋巴细胞高表达BATF且具有较强的抑制效应功能[11],在CD4 T淋巴细胞研究中发现BATF可以促进Th17的分化,诱导Th2分化增殖[12],促进免疫负性调控分子CTLA-4和免疫抑制型细胞因子IL-10的表达[10];BATF2主要表达于M1型巨噬细胞,参与Th1免疫反应。

本研究集中于BATF家族中的BATF,发现BATF在活动性结核患者外周血CD4和CD8 T淋巴细胞中的表达显著高于潜伏性结核感染者和健康对照者,且在活动性结核患者中表达BATF的T淋巴细胞比例和表达PD-1的T淋巴细胞比例存在显著正相关,进一步通过阻断PD-1/PD-L通路,在活动性结核患者外周血T淋巴细胞中检测BATF表达的变化,结果显示阻断PD-1受体时表达BATF的CD8 T淋巴细胞比例下降,阻断其配体PD-L1/L2时,表达BATF的CD4和CD8 T淋巴细胞比例均下降。这一结果表明,BATF可能是存在于PD-1下游的转录因子,活动性结核患者外周血T淋巴细胞高表达PD-1,使BATF的表达也升高,BATF通过抑制AP-1的转录活化信号,负性调控结核免疫。

BATF参与调节滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh)IL-4的产生,敲除BATF使分泌IL-4的Tfh减少可预防过敏性哮喘[13]。Punkenburg等[14]发现BATF在溃疡性结肠炎和结直肠癌组织中高表达,在小鼠模型中,通过敲除BATF可以减少结直肠癌的形成。目前BATF在感染性疾病中的研究主要集中于病毒感染,如EBV、HIV等[3,15,16];在细菌感染尤其是结核中的研究较少。Roy等[17]在小鼠中发现用γ干扰素刺激的巨噬细胞高表达BATF2,在γ干扰素刺激之后用结核分枝杆菌以及单独用结核分枝杆菌感染巨噬细胞,BATF和BATF2的表达都升高。Roe等[18]在多个临床研究队列中证实,HIV阴性人群中BATF2在活动性结核患者外周血中的表达显著高于潜伏性结核感染者和健康对照者,且外周血中BATF2的表达可作为一种生物标志物用来诊断活动性结核,在3个队列中受试者工作特征曲线下面积为0.93~0.99。活动性结核患者完成抗结核治疗2~4年后发现,外周血BATF2的表达比未治疗时显著下降。而在合并HIV感染的潜伏性结核感染者中BATF2的表达要高于HIV阴性的潜伏性结核感染者。关于BATF在活动性结核患者外周血中升高的原因以及其作用机制还在进一步探索中。

综上所述,BATF作为一个在结核中新近发现的可能是PD-1/PD-L通路发挥免疫负性调控作用的重要分子,还需进一步研究其在结核中的作用机制,为临床的诊断和治疗提供帮助,对研究以BATF为靶点的新型抗结核免疫治疗提供理论依据。

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主题词
碱性亮氨酸拉链ATF样蛋白
程序性死亡受体-1
结核
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