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综述
自然杀伤细胞G2家族介导的自然杀伤细胞活化在丙型肝炎病毒感染中的作用
中华传染病杂志, 2017,35(06): 376-379. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.014
摘要
引用本文: 马路园, 王亚东, 王玮, 等.  自然杀伤细胞G2家族介导的自然杀伤细胞活化在丙型肝炎病毒感染中的作用 [J]. 中华传染病杂志,2017,35( 6 ): 376-379. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.014
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直接抗病毒药物(direct antiviral agent,DAA)为治疗丙型肝炎带来划时代的意义,使大多数患者实现了病毒清除、临床治愈的目标,但仍有少部分患者会出现停药后复发、肝脏炎性反应与纤维化进展、甚至进展为肝细胞癌。因此,深入了解HCV感染后机体的免疫应答和机制是有效防控肝脏病变进展的关键。

固有免疫应答作为机体抵抗病毒感染的第一道防线,在感染早期的免疫监视及病毒清除过程中发挥重要作用。NK细胞作为固有免疫的核心部分在肝脏富集,在病毒感染早期非特异免疫清除中协同DC、T淋巴细胞发挥重要作用,也是影响HCV感染后慢性化、重症化进程的重要参与者[1]。自然杀伤细胞G2(natural killer group 2,NKG2)家族在NK细胞发挥抗病毒免疫中的作用备受关注。现就NKG2介导NK细胞活化在HCV感染后对疾病转归及抗病毒应答的影响及其机制做一综述,为临床有效防控慢性HCV感染提供依据。

一、NK细胞与NKG2家族

NK细胞是机体重要的免疫细胞,是固有免疫系统中重要成员,参与机体抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等。NK细胞在肝脏富集,外周血中NK细胞占5%~10%,肝脏中可占30%,在肝脏病变中甚至可达50%[2]。机体感染HCV时,NK细胞可释放穿孔素、颗粒酶、TNF受体超家族成员等细胞毒效应介质,快速识别和裂解被感染的肝细胞,导致病毒感染靶细胞凋亡。NK细胞还通过启动并调节DC、T淋巴细胞等来调控特异性免疫系统,同时产生免疫记忆强化抗病毒效应。因此,HCV感染后NK细胞可发挥重要的"前锋"和"枢纽"作用[3]。NKG2家族是NK细胞表面重要的受体家族之一,包括识别人类白细胞抗原-1(human leukocyte antigen 1,HLA-1)类分子的受体和识别非HLA-1类分子的受体。又根据介导NK细胞功能的不同,分为活化性受体和抑制性受体。其中,NKG2A识别正常表达于所有细胞表面的HLA-1类分子,为抑制性受体,维持NK细胞免疫耐受,避免对自身组织细胞过度杀伤。NKG2C属于活化性受体,与无信号转导功能的CD94结合,识别HLA-1类分子的受体,增强NK细胞介导的抗病毒作用。NKG2D是目前研究较多的NKG2家族活化性受体,主要识别NK细胞非HLA-1类分子,NK细胞表面NKG2D与配体结合后通过YxxM基序结合胞内P13K亚单位P85和Grb2传递共刺激信号,最终借助细胞外信号调节激酶启动效应因子穿孔素、颗粒酶、γ干扰素等合成、释放,参与杀伤肿瘤和病毒感染靶细胞,发挥非特异性免疫清除病毒作用[3,4,5]。NKG2家族其他受体NKG2B、NKG2E、NKG2F也属于活化性受体,参与HCV感染后疾病进展及治疗应答,但相比NKG2A、NKG2C及NKG2D,在病毒性肝炎领域目前研究较少。正常情况下,以NKG2A为代表的抑制性受体占优势,使NK细胞处于抑制状态,维持机体免疫耐受。当病毒感染机体后,诱导NKG2家族中活化性受体NKG2D、NKG2C等表达增加,NK细胞活化,伴随靶细胞相应配体NKG2D-主要组织相容复合体相关基因A(MICA)等表达上调,启动NK细胞介导的固有免疫应答过程。因此,HCV感染后NKG2家族介导的NK细胞功能变化是影响机体免疫应答的重要因素,其中活化性受体介导NK细胞清除病毒感染靶细胞是HCV感染后的重要应答方向。

二、NKG2与HCV感染后免疫

HCV感染后,一方面固有免疫及适应性免疫可介导直接抗病毒反应进而清除病毒;另一方面通过多种途径逃避机体免疫监视及抗病毒应答,导致感染慢性化。其中HCV可直接或间接影响NK细胞表面受体表达及其功能,使HCV感染肝细胞逃避免疫清除作用。HCV非结构蛋白NS5A介导TGF-β产生,减少NK细胞表面NKG2D表达,使NK细胞清除病毒能力降低,NS3/4A可使病毒感染肝细胞表面NKG2D配体MICA和MICB表达下调,降低NK细胞对靶细胞的杀伤效应[5,6,7]。此外,与HCV感染肝细胞之间的接触也使NK细胞活化性受体NKG2D、NKp30表达减少,γ干扰素分泌减少及NK细胞脱颗粒能力下降[8,9,10]。HCV感染后不同疾病时期及抗病毒过程均可检测到NKG2家族或其配体表达,通过影响NK细胞功能干预疾病进展及抗病毒免疫应答。

1.急性HCV感染时NKG2介导NK细胞可影响疾病转归:

急性HCV感染阶段,NK细胞数量及功能可影响病毒清除导致不同感染结局。Amadei等[11]检测HCV感染后外周血NK细胞数量、功能及其受体,发现急性HCV感染阶段NK细胞活化数量明显增加,脱颗粒及溶细胞作用及清除病毒感染靶细胞能力增强,且NKG2D表达增加,均与急性期清除病毒相关。Alter等[12]发现,急性HCV感染阶段抑制性受体NKG2A表达增加,表达NKp30、NKp46、NKG2D及CD161的NK细胞数量减少,不利于清除病毒,导致感染慢性化;而在自发清除病毒的患者体内NKG2A表达减少,减弱了对NK细胞的抑制,从而清除病毒。Kokordelis等[13]亦证实,HCV感染后可自发清除病毒的患者NK细胞表面NKG2A表达减少,NKG2D、NKp46增加,γ干扰素产生增加,NK细胞杀伤HCV感染肝细胞作用增强,最终清除病毒。Pelletier等[9]测定HCV感染者NK细胞表面受体,发现11例自发清除病毒患者体内NK细胞表面NKG2A表达减低,且NKG2A可能作为预测HCV感染后是否能够自发清除病毒的指标,而NKG2D在HCV感染后不同疾病转归患者体内表达无明显差异。总之,在HCV感染急性阶段,NKG2A表达减少,NK细胞清除病毒能力增强,机体可自发清除病毒。NKG2D在HCV感染急性阶段表达增加,结论尚不统一,但其表达情况可影响病毒清除及复制。

2.NKG2介导的NK细胞功能异常与HCV感染慢性化:

HCV感染后NK细胞表面活化性受体NKG2C、NKG2D表达增加,而抑制性受体NKG2A表达亦增加,NK细胞脱颗粒作用增强[14,15]。而Varchetta等[16]研究发现,尽管慢性HCV感染者肝脏NK细胞表面NKG2D表达增加,但高表达的NKG2D并没有增强NK细胞功能,反而引起NK细胞功能耗竭从而导致其清除病毒能力下降,使得HCV感染慢性化。Ahlenstiel等[14]通过测定42例HCV感染者抗病毒治疗前NK细胞表面受体的变化发现,肝脏中NK细胞表面NKp44、NKG2C等活化性受体表达升高,NK细胞清除病毒能力增强;而NKG2A亦增加,分析可能机制为慢性炎性反应介导的肝细胞保护性机制引起NKG2A增加。Sène等[17]通过免疫磁珠阴性选择法从34例慢性丙型肝炎患者外周血及肝组织中分离NK细胞,发现外周血NK细胞表达NKG2D下调,NK细胞脱颗粒能力下降,γ干扰素产生减少,清除病毒能力被削弱。进一步用重组大肠杆菌来源的HCV非结构蛋白NS3、NS4和NS5转染Huh-7.5.1细胞系进行体外研究,发现HCV相关蛋白可通过减少NKG2D的表达使病毒逃避NK细胞杀伤作用。总之,NK细胞功能及表面受体活化受多种因素调控,在HCV感染初期NK细胞表面多种活化性受体NKG2C、NKG2D等表达增加,机体以清除病毒和免疫防御为主;然而随着HCV持续复制,多种免疫因子持续作用于NK细胞,NK细胞表面NKG2A的表达增加,NK细胞功能受抑制,导致HCV感染肝细胞逃避宿主免疫清除,进而出现HCV感染慢性化[18,19,20]。其他HCV慢性化的可能机制为NK细胞功能持续激活引起功能耗竭,NKG2D表达减少,最终导致NK细胞功能低下。

3.NKG2介导的NK细胞阻止HCV感染后肝纤维化:

肝纤维化是慢性丙型肝炎向HCV相关肝硬化进展的关键环节,肝纤维化形成过程受包括NK细胞在内的多种免疫细胞、细胞因子调控。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纤维形成的关键细胞。研究发现,在正常人体HSC占肝脏细胞的5%~8%,且保持静止状态[20]。HCV感染后,病毒核心蛋白及结构蛋白可诱导HSC活化,活化后的HSC细胞进一步增殖、迁移,产生细胞外基质导致肝纤维化发生,NK细胞通过及时清除过度活化的HSC,抑制病毒感染后肝纤维化进程[21]。另有研究证实,活化的HSC可以下调NK细胞抑制性MHC-1类分子配体、上调TNF相关诱导凋亡配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)表达,促使NK细胞通过NKG2D活化、释放穿孔素和颗粒酶,加之TRAIL配体的高表达均促使机体杀伤HSC,抑制肝纤维化进展[15]。Glässner等[22]将HCV感染者外周血提取的NK细胞与HSC共培养观察NK细胞对HSC作用,结果证实,NK细胞通过表面TRAIL、人凋亡相关因子配体和NKG2D机制杀伤HSC。NK细胞与HSC对话的一个关键机制在于早期活化的HSC表面NKG2D配体视黄酸早期转录蛋白-1表达升高,协同MICA、NKp46的配体活化NK细胞发挥杀伤HSC作用,抑制肝纤维化进展[23]。Radaeva等[24]在小鼠肝纤维化造模过程中同时肌内注射聚肌苷酸-聚胞苷酸,继而通过流式细胞术及免疫印迹法测定NK细胞表面受体及其活性,发现聚肌苷酸-聚胞苷酸可经NKG2D、TRAIL受体途径活化NK细胞,灭活HSC,抑制肝纤维化进展。因此HCV感染后病毒可通过直接或者间接方式促进NK细胞活化,调节肝纤维化的发生发展。

4.NKG2介导的NK细胞功能与HCV感染相关肝癌:

慢性HCV感染最终导致肝硬化,部分患者发生肝细胞癌。近年来越来越多的研究证实,NK细胞数量及功能减低是导致肝癌发生的重要机制之一。正常情况下,NKG2介导的NK细胞活化可与其他免疫细胞协同发挥免疫监视、免疫清除作用而预防肝细胞癌的发生。研究发现,肝癌患者外周血NK细胞表面NKG2A、NKG2D表达均减少,NK细胞功能低下,不利于机体对异常增殖细胞的清除[25]。HCV感染肝细胞后,病毒非结构蛋白NS5A可以直接或间接减少NK细胞表面NKG2D,同时HCV蛋白NS2、NS3/4A、NS5B使得肝细胞表面NKG2D配体减少,使得NK细胞活化障碍,抑制对肝异常增殖细胞的免疫监视及非特异性清除作用,导致肝细胞癌变[7,26]。另有临床研究证实,肝癌患者血清NKG2D可溶性MICA(sMICA)配体水平明显增高,竞争性抑制NKG2D与其配体MICA作用,逃避NK细胞对肝癌细胞的免疫监视、抑制其清除异常增殖细胞的功能。索拉非尼是近年来上市第一个抗肝癌的分子靶向药物,可以通过增加肝癌细胞膜表面NKG2D配体MICA,减少sMICA表达,促进NK细胞清除肝癌细胞[4]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一类新的抗癌药物,其可以促进肝癌细胞表面NKG2D配体MICA或者MICB的表达,增加NK细胞介导的清除肝癌细胞的能力[27]

5.NKG2介导NK细胞功能与抗病毒治疗应答:

目前对于所有HCV现症感染者在启动抗病毒治疗方案前需根据病毒载量、基因分型、肝纤维化分期,以及有无抗病毒治疗禁忌证等综合评估。在DAA上市以前,干扰素联合利巴韦林是抗病毒治疗的主要方案。最新研究发现,NKG2D的rs1049174基因是预测慢性丙型肝炎患者经干扰素联合利巴韦林治疗后达到持续病毒学应答的有效指标[28]。研究发现,应用干扰素后数小时内便可测得NKG2D、NKp30表达增加,而NKG2C、NKG2A表达减少,NK细胞活化进而发挥抗病毒作用[29]。基础研究发现,NS3/4A蛋白酶抑制剂可以减弱HCV感染后NK细胞接触性抑制,促进NK细胞表面活化性受体NKG2D、NKp30以及靶细胞表面NKG2D配体表达,有利于NK细胞发挥清除病毒作用。NS5A蛋白酶抑制剂可以使NKG2D表达增加,促进NK细胞发挥杀伤靶细胞作用[8]。目前DAA与干扰素联合利巴韦林互补的治疗方案在各种HCV基因型患者的治疗中取得了良好效果。Spaan等[30]通过流式细胞术检测DAA、干扰素联合利巴韦林治疗的慢性丙型肝炎患者外周血及肝脏NK细胞表面受体表达情况时发现,治疗12周可检测到外周血NK细胞抑制性受体NKG2A表达明显增加,提示治疗后期随着机体病毒载量下降及长时间的抗病毒免疫反应导致外周血NK细胞功能降低,推测这是机体防止病毒感染肝细胞因抗病毒免疫引起炎性损伤的代偿反应。Spaan等[31]通过分析12例慢性丙型肝炎患者仅用DAA药物治疗后NK细胞的变化,发现DAA诱导NK细胞抑制性受体NKG2A表达明显减低,与机体清除病毒有关;而NKG2C、NKG2D在治疗过程中无明显变化。Serti等[32]通过检测13例经干扰素联合利巴韦林治疗失败的慢性丙型肝炎患者在接受DAA治疗前及治疗后外周血及肝脏NK细胞表型及功能发现,DAA介导的抗病毒治疗使得NK细胞活性增加,细胞毒性功能恢复正常;治疗前外周血NKG2A较正常对照者表达增加,治疗8周后病毒载量快速下降的9例患者NKG2A水平恢复正常,且恢复速度较应答缓慢的3例患者快。但此过程中患者NKG2C、NKG2D的水平并无明显变化。因此,DAA药物可能通过影响NKG2家族从而恢复NK细胞功能,促进其清除病毒。NKG2家族相关受体能否作为预测治疗应答反应的敏感性指标尚有待大样本、多中心临床研究证实。

综上所述,NKG2家族参与调控NK细胞活性及功能,影响HCV感染急性期转归、慢性化、肝纤维化和肝癌的发生发展,也是抗HCV药物发挥抗病毒作用的主要机制之一。

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