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短篇论著
结核感染T淋巴细胞斑点试验对结核病患者的诊断价值
中华传染病杂志, 2017,35(06): 369-371. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.010
摘要
引用本文: 甄国东, 茅利明, 赵斐, 等.  结核感染T淋巴细胞斑点试验对结核病患者的诊断价值 [J]. 中华传染病杂志,2017,35( 6 ): 369-371. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.010
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流行病学调查结果显示,我国结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的人数超过5亿,结核病患者人数位居全球第3位,每年新发病例150多万,约13万人死于MTB感染[1,2,3]。抗酸染色涂片和MTB培养是目前最常用的检测方法,但存在阳性率低、检测周期长,敏感度和特异度不高等缺陷[4]。另外,肺外结核的不典型临床表现,以及病灶部位MTB量的不足,使得肺外结核的诊断存在更大的挑战。因此,需要寻找准确、快速、可靠的结核病诊断方法。

本研究采用结核感染T淋巴细胞斑点试验(tuberculosis T cell spot detection, T-SPOT.TB)检测临床疑似结核病患者,并与临床诊断结果进行对比分析,评价T-SPOT.TB对诊断肺结核与肺外结核病的临床应用价值。

对象与方法
一、研究对象和诊断标准

研究对象为中国医科大学绍兴医院2014年1月至2015年12月收治的结核病疑似患者1 570例,男843例,女727例,年龄16~81岁,中位年龄55岁。其中肺结核患者258例(肺结核组),肺外结核患者134例(肺外结核组),非结核病患者1 178例(非结核病组)。

肺结核诊断标准为痰涂片MTB阳性,痰培养MTB阳性或组织病理学检查阳性[5];MTB痰培养阴性,但临床表现和影像学支持肺结核诊断,且抗结核药物治疗有效。肺外结核诊断标准为细菌学或组织病理学确诊及临床诊断肺外结核,有发热、盗汗等结核病症状,有相应的肺外结核局部表现及影像学表现,相应的体液或组织涂片抗酸染色、MTB培养阳性或组织病理学检查阳性;或相应的体液或组织MTB培养阴性,但临床表现和影像学支持肺外结核诊断,且抗结核治疗有效。非结核病诊断标准为临床表现明确为其他疾病所致,或经其他治疗(非抗结核治疗)病情改善。排除HIV阳性患者。

二、研究方法

T-SPOT.TB试剂盒采用英国Oxford Immunotec Ltd产品(批号:TEC314599),用CPT真空管采集患者外周血8 mL,室温放置<4 h。先每孔加入50 μL细胞培养液,再依次加入50 μL抗原A[相对分子质量为6 000的早期分泌抗原靶(early secretory antigenic target-6,ESAT-6)]、抗原B[相对分子质量为10 000的培养滤液蛋白(cultrue filtrate protein-10,CFP-10)]溶液和100 μL患者细胞终溶液(每孔约25万个活细胞),阴、阳性对照标本做同步处理。体积分数为0.05的CO2培养箱中37 ℃温育16~20 h,弃去培养液,PBS洗涤,每孔加入50 μL生物素标记的二抗于2~8 ℃温育1 h,再加入50 μL底物显色液温育7 min,蒸馏水洗涤培养板终止反应。应用酶联斑点分析仪计数着色的细胞斑点形成数(SFC),当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果:①阴性对照SFC为0~5个,(A或B孔斑点数)-(阴性孔斑点数)≥6个,判断为阳性;②阴性对照SFC为6~10个,(A或B孔斑点数)≥2倍阴性孔斑点数,判断为阳性;若A、B孔SFC不够以上标准,且阳性对照反应良好,则为阴性。若阴性对照孔SFC超过10个,阳性对照孔SFC<20个时,则结果不能确定。

对T-SPOT.TB筛查阳性的90例肺外结核病患者抗结核药物治疗1个月后,再次进行T-SPOT.TB检测,记录其斑点数,并跟踪3及6个月后的治疗情况。

三、统计学分析

采用SPSS 16.0进行统计学分析。非正态分布的计量数据以M(P25P75)表示,组间比较采用秩和检验,组间样本率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、临床诊断情况

258例肺结核患者中,81例经细菌学确诊,55例经组织病理学确诊,5例同时经细菌学和组织病理学确诊,临床诊断肺结核病患者117例。134例肺外结核患者中,31例经细菌学确诊,27例经组织病理学确诊,76例经临床诊断;其中结核性腹膜炎37例,结核性胸膜炎28例,结核性脑膜炎18例,淋巴结结核17例,骨关节结核17例,肠结核14例,肾结核3例。1 178例非结核病患者中,肺炎351例,肺间质纤维化148例,慢性阻塞性肺病217例,慢性支气管炎347例,支气管扩张115例。

二、T-SPOT.TB检测结果

肺结核和肺外结核患者T-SPOT.TB的阳性率均显著高于非结核病患者,差异有统计学意义(χ2=881.9,P<0.05),肺结核和肺外结核患者T-SPOT.TB的阳性率差异无统计学意义(χ2=1.76,P>0.05)。见表1。T-SPOT.TB诊断结核病的敏感度为84.7%(332/392),特异度为92.2%(1 086/1 178),阳性预测值为78.3%(332/424),阴性预测值为94.8%(1 086/1 146 ),阳性似然比为10.8,阴性似然比为0.16。

表1

各组患者T-SPOT.TB检测结果(例)

表1

各组患者T-SPOT.TB检测结果(例)

组别例数T-SPOT.TB阳性率(%)
阳性阴性
肺结核组2582233586.4
 细菌和病理学确诊1411311092.9
 临床诊断117922578.6
肺外结核组1341092581.3
 细菌和病理学确诊5849984.5
 临床诊断76601678.9
非结核病组1 178921 0867.7

注:T-SPOT.TB为结核感染T淋巴细胞斑点试验

抗结核治疗前134例肺外结核患者T-SPOT.TB检测结果见表2,除结核性脑膜炎和肾结核(样本数较少)外,其他肺外结核T-SPOT.TB的敏感度良好。

表2

肺外结核组T-SPOT.TB检测敏感度

表2

肺外结核组T-SPOT.TB检测敏感度

肺外结核例数T-SPOT.TB敏感度(%)
阳性阴性
结核性腹膜炎3733489.2
结核性胸膜炎2823582.1
结核性脑膜炎1812666.7
淋巴结核1716194.1
骨、关节结核1713476.5
肠结核1410471.4
肾结核32166.7
合计1341092581.3

注:T-SPOT.TB为结核感染T淋巴细胞斑点试验

三、结核病和非结核病患者的斑点数比较

结核病组的SFC中抗原A(ESAT-6)为73个(60,94)/106 PBMC,抗原B(CFP-10)为48个(35,78)/106 PBMC;非结核病组抗原A(ESAT-6)为2个(0,2)/106 PBMC,抗原B(CFP-10)为2个(0,2)/106 PBMC,两组差异有统计学意义(χ2=58.567,P<0.01)。

四、抗结核治疗前后T-SPOT.TB检测结果

共有90例肺外结核病患者在应用抗结核药物异烟肼(H)、利福平(R)、乙胺丁醇(E)、吡嗪酰胺(S)四联方案治疗1个月后再次进行T-SPOT.TB检测。治疗前SFC中抗原A(ESAT-6)为78个(60,96)/106 PBMC,抗原B(CFP-10)为45个(35,75)/106 PBMC;治疗后SFC中抗原A(ESAT-6)为42个(34,54)/106 PBMC,抗原B(CFP-10)为28个(19,35)/106 PBMC,差异有统计学意义(t=0.121,P<0.05)。治疗3个月后,39例患者进行T-SPOT.TB检测,23例T-SPOT.TB检测阴性,SFC<5个/106 PBMC,13例SFC为8~17个/106 PBMC,3例无明显下降。另51例患者因各种原因未进行T-SPOT.TB检测。2例穿刺液培养为HRES耐药,1例经基因检测为HR耐药,调整方案为吡嗪酰胺、莫西沙星、阿米卡星、对氨基水杨酸、异烟肼、利奈唑胺,6个月后随访,病情好转。

讨论

结核病特别是肺外结核发病多样性、多脏器以及临床症状不典型性,依据病原学诊断较困难,大多需手术或创伤性活组织检查以及CT、MRI等手段以确诊,因而肺外结核病诊断十分困难[5]。T-SPOT.TB由酶联免疫斑点法发展而来,是以RDl编码的ESAT-6和CFP-10作为T淋巴细胞特异性刺激原,应用酶联免疫斑点法检测外周血中MTB特异性释放γ干扰素的T淋巴细胞而建立[6]。文献报道,T-SPOT.TB诊断结核病具有较高的敏感度和特异度[7,8,9]。2008年,美国FDA将T-SPOT.TB作为第4种γ干扰素释放试验(interferon-gamma release assay, IGRA)批准使用。该试验纳入了结核特异抗原,排除了卡介苗和绝大多数非结核分枝杆菌的干扰,能够有效诊断结核分枝杆菌感染,且不受机体CD4T淋巴细胞影响,操作简单、周期短,有较高的临床应用价值[10,11]

本研究结果显示,肺结核组和肺外结核组T-SPOT.TB的阳性率均显著高于非结核病组,而肺结核组和肺外结核组T-SPOT.TB阳性率的组间差异无统计学意义。T-SPOT.TB诊断结核病的敏感度为84.7%,特异度为92.2%,与国内文献报道结果基本一致[12,13,14];诊断肺外结核病的敏感度为81.3%,略低于文献报道的94%[15],可能与病例数有关。非结核病组患者T-SPOT.TB检测结果中有92例阳性,但临床表现明确为其他疾病所致,经非抗结核治疗病情改善,可能是堪萨斯、苏氏、戈登或海分枝杆菌等非结核分枝杆菌感染所致[16]。有文献报道,CD8T淋巴细胞可分泌γ干扰素,这也可能是T-SPOT.TB阳性的原因之一[17,18]

IGRA的反应性主要受到结核特异性抗原数量和宿主免疫状态的影响,不能百分之百地检测到潜伏性结核感染,因为ESAT-6和CFP-10在潜伏感染时不是高表达[19]。结核特异性效应T淋巴细胞在体内存活期很短,一般在病原体消灭后即消失[20]。T-SPOT.TB是应用酶联免疫斑点法对全血中的致敏T淋巴细胞二次接受特异性抗原刺激后释放的γ干扰素作相应的定量检测,所以γ干扰素的水平能够被用作诊断结核分枝杆菌感染严重程度的指标[21]。一项结核病患者抗结核治疗前后T-SPOT.TB检测结果显示,治疗前T-SPOT.TB检测的阳性率为83%,显著高于治疗后的17%[22]。约55%的结核病患者在抗结核治疗1年后T-SPOT.TB检测结果转为阴性[23]。本研究中90例肺外结核病患者在抗结核治疗1个月后复查T-SPOT.TB,检测值较治疗前显著降低,差异有统计学意义,与文献报道结果一致[24]。原因可能是抗结核治疗会减少结核特异性抗原载量,降低IGRA的反应性,从而导致SFC减少。依据T-SPOT.TB检测结果指导抗结核治疗,与传统诊断方法比较,可减少30%的抗结核药物[25],有效降低了因抗结核药物带来的经济负担,减少不良反应。由此可见,T-SPOT.TB动态检测可用于评价患者抗结核治疗的有效性。

总之,T-SPOT.TB对于诊断肺结核及肺外结核具有较高的敏感度和特异度,较高的临床应用价值。对于T-SPOT.TB阳性的患者给予预防性的抗结核治疗,可有效且最大程度地减低结核病复发风险;也可动态观察结核病患者治疗的效果,节约诊断时间,更好利用医疗资源同时减轻患者负担。

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