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论著
细胞因子信号转导抑制物-3及固醇调节元件结合蛋白-1c通路在脂肪变性HepG2/HepG2.2.15细胞中的变化
中华传染病杂志, 2017,35(06): 326-331. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.002
摘要
目的

探讨HepG2和HepG2.2.15细胞脂肪变性对细胞因子信号转导抑制物-3(supressors of cytokine signaling-3,SOCS-3)、固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding proteins,SREBP-1c) mRNA和蛋白表达的影响。

方法

油酸诱导HepG2和HepG2.2.15细胞脂肪变性,成功构建脂变的细胞模型,分为HepG2对照组、HepG2.2.15对照组、HepG2脂变组和HepG2.2.15脂变组。实时定量PCR法检测细胞中SOCS-3及SREBP-1c mRNA的表达情况,蛋白质印迹法测定细胞中SOCS-3及SREBP-1c蛋白的表达变化。统计学处理采用单因素方差分析和Tukey法。

结果

SOCS-3 mRNA表达水平,HepG2.2.15对照组显著低于HepG2对照组,HepG2脂变组显著低于HepG2对照组,差异均有统计学意义(均P<0.01);HepG2.2.15脂变组较HepG2.2.15对照组也降低,但差异无统计学意义(P=0.173);细胞与脂变有交互作用(F=25.547,P<0.01)。SREBP-1c mRNA水平,HepG2.2.15对照组表达低于HepG2对照组,HepG2.2.15脂变组表达明显高于HepG2.2.15对照组,差异均有统计学意义(均P<0.01);HepG2脂变组与HepG2对照组差异无统计学意义(P=1.000);细胞与脂变有交互作用(F=5.04,P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,两组细胞脂变48、72 h后SOCS-3和SREBP-1c蛋白水平显著高于非脂变细胞。

结论

两组细胞脂变后SOCS-3和SREBP-1c蛋白的表达出现上调。细胞与脂变之间存在交互作用,HBV基因可以抑制脂变细胞SOCS-3 mRNA的表达,促进SREBP-1c mRNA的表达。

引用本文: 王艳, 赵龙凤, 王荣荣, 等.  细胞因子信号转导抑制物-3及固醇调节元件结合蛋白-1c通路在脂肪变性HepG2/HepG2.2.15细胞中的变化 [J]. 中华传染病杂志,2017,35( 6 ): 326-331. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2017.06.002
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CHB是一个全球性的公共卫生问题,严重危害人类健康。非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征,是除乙型肝炎外的第二大肝病。临床研究发现,我国CHB合并NAFLD的发病率为11%~15%[1,2]。胰岛素抵抗(IR)是NAFLD发生的中心环节,脂肪肝的"多重打击学说"中第一重打击就是来自IR[3]。细胞因子信号转导抑制物-3(supressors of cytokine signaling-3,SOCS-3)是一类具有抑制Janus激酶/信号转导和转录激活因子的调节因子,可以通过调节胰岛素信号转导和细胞因子信号转导,在脂肪肝的IR机制中发挥重要作用[4]。固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding proteins,SREBP-1c)是脂肪合成基因的主要转录调节因子,参与脂质的代谢平衡,在NAFLD的发生过程中发挥重要的作用[5]。本研究利用油酸诱导HepG2.2.15细胞脂肪变性,成功构建出CHB合并NAFLD的细胞模型,通过检测HepG2.2.15细胞脂肪变性过程中SOCS-3和SREBP-1c mRNA及蛋白的表达变化,观察存在HBV的肝细胞在发生脂肪变性过程中其IR和脂质合成通路的变化规律,探讨其发病机制。

材料与方法
一、实验材料

HepG2细胞由山西省长治医学院感染病科实验室惠赠,HepG2.2.15细胞购自解放军第三○二医院感染病科实验室。DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司,兔抗人SOCS-3抗体、兔抗人SREBP-1抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,SOCS-3、SREBP-1c及内参引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司,反转录试剂盒购自美国Fermentas公司,FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)购自德国罗氏公司,其他试剂均为进口或国产分析纯。倒置显微镜和正置荧光显微镜为日本Olympus公司产品,实时荧光定量PCR仪购自美国MJ Research公司,凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

二、实验方法
1.细胞培养:

将HepG2和HepG2.2.15细胞置于含10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM),体积分数为0.05的CO2 37 ℃温育。每日观察培养细胞的生长状况,待细胞呈现80%~90%连续生长时,采用噻唑蓝法对细胞进行计数及活力鉴定,并根据细胞数校正实验结果。

2.细胞脂肪变性模型的构建:

设定0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L的油酸(OA)浓度梯度对HepG2.2.15细胞进行脂肪变性诱导。细胞分为对照组、二甲基亚砜(DMSO,OA溶剂)组和不同浓度油酸组。通过噻唑蓝法检测细胞相对活性并制作细胞生长曲线,油红O-苏木素染色观察细胞内脂滴情况并计算脂变率,确定HepG2.2.15细胞脂肪变性的最佳浓度和作用时间,然后将该最适浓度与作用时间用于HepG2细胞,并观察相同条件下HepG2细胞的脂变情况。

3.实时荧光定量PCR检测:

将细胞分为HepG2对照组、HepG2.2.15对照组、HepG2脂变组、HepG2.2.15脂变组,分别接种于培养瓶中,培养72 h后,采用TRIzol一步法提取各组细胞RNA。反转录按照反转录试剂盒说明合成cDNA。SOCS-3和SREBP-1c mRNA采用FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) PCR试剂盒在PCR扩增仪上进行检测,以GAPDH为内参照,各引物序列见表1。PCR体系:SYBR 10 μL,引物0.01 μL(用0.1%焦碳酸二乙酯水稀释至7 μL)和cDNA模板3 μl,PCR反应循环40次。反应完成后计算Ct值,所检测的细胞内的SOCS-3、SREBP-1c基因量=2-△△Ct

表1

SOCS-3、SREBP-1c及内参基因引物序列

表1

SOCS-3、SREBP-1c及内参基因引物序列

引物名称引物序列(5′→ 3′)
GAPDH上游:TGAACGGGAAGCACGTCACTGG  
下游:TCCACCACCCTGTTGCTGTA
SOCS-3上游:ATCCTGGTGACATGCTCCTC  
 下游:CAAATGTTGCTTCCCCCTTA
SREBP-1c上游:TGCATTTTCTGACACGCTTC  
下游:CCAAGCTGTACAGGCTCTCC

注:SOCS-3为细胞因子信号转导抑制物-3;SREBP-1c为固醇调节元件结合蛋白-1c;GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶

4.蛋白质印迹法分析:

收集油酸处理0、48、72 h的HepG2和HepG2.2.15细胞,放射免疫沉淀分析(RIPA)细胞裂解液提取各组细胞总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度,取30 μg总蛋白上样,蛋白质印迹法测定各组细胞的SOCS-3及SREBP-1c蛋白表达水平,内参蛋白为GAPDH。曝光显影后分析各条带的吸光度(A)值,各组SOCS-3和SREBP-1c蛋白相对表达强度用目的蛋白的总A值/ GAPDH的总A值表示。

三、统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件。数据经对数转换至正态,正态分布的计量数据以±s表示,细胞与脂变两因素的析因分析采用单因素方差分析法,多组间比较采用Tukey法。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、HepG2和HepG2.2.15细胞脂肪变性模型建立的实验条件

根据各组细胞的平均A值绘制的HepG2.2.15细胞生长曲线显示,0.2%的DMSO及浓度≤0.2 mmol/L的油酸不影响细胞的增殖活力;当油酸浓度>0.2 mmol/L时,随着油酸浓度的增高,细胞的增殖能力逐渐下降,因此选择不影响细胞增殖活力的最大浓度(0.2 mmol/L)油酸诱导细胞脂肪变性,见图1。油红O-苏木精染色显示,在0.2 mmol/L浓度油酸培养条件下,HepG2和HepG2.2.15细胞内24 h时开始出现橘红色小脂滴,随着培养时间的延长脂滴逐渐增大、增多,在不影响细胞增殖能力的情况下72 h时形成明显脂变,见图2。HepG2.2.15细胞在24、48 h时的平均脂变率均低于HepG2细胞(P值分别为0.028、0.022),72 h时差异无统计学意义(P>0.05),见图3。因此,最终确定HepG2和HepG2.2.15细胞脂肪变性条件为0.2 mmol/L油酸培养72 h。

图1
不同浓度油酸作用下HepG2.2.15细胞生长曲线
图1
不同浓度油酸作用下HepG2.2.15细胞生长曲线
图2
HepG2和HepG2.2.15细胞0.2 mmol/L油酸不同作用时间的油红O-苏木精染色结果(高倍放大)

注:A、B、C、D分别为HepG2细胞0、24、48、72 h的油红O-苏木精染色图;E、F、G、H分别为HepG2.2.15细胞0、24、48、72 h的油红O-苏木精染色图

图2
HepG2和HepG2.2.15细胞0.2 mmol/L油酸不同作用时间的油红O-苏木精染色结果(高倍放大)
图3
0.2 mmol/L油酸作用下HepG2和HepG2.2.15细胞脂变率比较
图3
0.2 mmol/L油酸作用下HepG2和HepG2.2.15细胞脂变率比较
二、HepG2和HepG2.2.15细胞中SOCS-3和SREBP-1c mRNA表达

实时荧光定量PCR检测结果显示,HepG2.2.15对照组SOCS-3和SREBP-1c mRNA水平显著低于HepG2对照组,HepG2.2.15脂变组SOCS-3和SREBP-1c mRNA水平显著低于HepG2脂变组,差异均有统计学意义(均P<0.05);HepG2脂变组SOCS-3 mRNA较HepG2对照组明显升高,差异有统计学意义(P=0.003),HepG2.2.15脂变组较HepG2.2.15对照组也出现升高,但差异无统计学意义(P=0.173),细胞与脂变有交互作用(F=25.547,P<0.01),提示脂变对SOCS-3 mRNA的影响与HBV有关,细胞脂变后SOCS-3 mRNA在HepG2细胞的上调程度高于HepG2.2.15细胞,HBV基因的存在可以抑制脂变细胞SOCS-3 mRNA的表达。两种细胞脂变后SREBP-1c mRNA的表达均上调,HepG2.2.15脂变组与HepG2.2.15对照组差异有统计学意义(P=0.002),HepG2脂变组组与HepG2对照组差异无统计学意义(P=1.000),细胞与脂变有交互作用(F=5.04,P<0.05),提示脂变对HepG2和HepG2.2.15细胞SREBP-1c mRNA表达的影响不同,HepG2.2.15细胞的上调程度高于HepG2细胞,HBV基因的存在可以促进脂变细胞SREBP-1c mRNA的表达。见表2表3

表2

HepG2及HepG2.2.15细胞SOCS-3、SREBP-1cmRNA表达水平比较(±s)

表2

HepG2及HepG2.2.15细胞SOCS-3、SREBP-1cmRNA表达水平比较(±s)

细胞分组例数SOCS-3mRNASREBP-1cmRNA
HepG2对照组629.50±17.271.17±0.68
HepG2脂变组6137.10±80.761.74±1.40
HepG2.2.15对照组60.83±0.570.23±0.05
HepG2.2.15脂变组61.76±1.030.59±0.19
ta 3.2500.195
Pa 0.0031.000
tb 1.9354.488
Pb 0.1730.002
tc 9.6303.377
Pc <0.010.013
td 4.1051.994
Pd <0.010.037

注:SOCS-3为细胞因子信号转导抑制物-3;SREBP-1c为固醇调节元件结合蛋白-1c。aHepG2对照组与HepG2脂变组比较;bHepG2.2.15对照组与HepG2.2.15脂变组比较;cHepG2对照组与HepG2.2.15对照组比较;dHepG2脂变组与HepG2.2.15脂变组比较

表3

细胞与脂变因素对SOCS-3、SREBP-1cmRNA的交互作用

表3

细胞与脂变因素对SOCS-3、SREBP-1cmRNA的交互作用

基因名称交互因素FP有无交互作用
SOCS-3 mRNA细胞与脂变25.547<0.01
SREBP-1c mRNA细胞与脂变5.040.03

注:SOCS-3为细胞因子信号转导抑制物-3;SREBP-1c为固醇调节元件结合蛋白-1c

三、HepG2和HepG2.2.15细胞中SOCS-3、SREBP-1c蛋白的表达情况

蛋白质印迹法结果显示,两组细胞经油酸处理48、72 h后,SOCS-3和SREBP-1c蛋白水平显著高于油酸处理0 h的细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05),且随脂变作用时间的延长,SOCS-3和SREBP-1c蛋白在HepG2和HepG2.2.15细胞中的表达有逐渐增强趋势,见图4

图4
HepG2和HepG2.2.15细胞中SOCS-3、SREBP-1c蛋白表达

注:SOCS-3为细胞因子信号转导抑制物-3;SREBP-1c为固醇调节元件结合蛋白-1c。A、B分别为HepG2细胞中SOCS-3、SREBP-1c蛋白在0、48、72 h时的表达;C、D分别为HepG2.2.15细胞中SOCS-3、SREBP-1c蛋白在0、48、72 h时的表达

图4
HepG2和HepG2.2.15细胞中SOCS-3、SREBP-1c蛋白表达
讨论

临床上很多CHB合并有NAFLD,这种现象越来越受到肝病学者的重视。来自中国杭州和台湾的两项大规模研究发现,HBsAg阳性人群中NAFLD的患病率分别为11.5%和12.6%[1,2]。施军平和范建高[6]对2 553例CHB患者进行肝活组织检查发现,有378例(14.81%)患者有肝脂肪变性。这些大规模的对CHB患者进行NAFLD的流调结果基本相似,NAFLD在CHB人群中的发生率为11%~15%,明显低于NAFLD在普通人群中的发病率(20%~30%)。CHB和NAFLD都是临床上常见的肝脏疾病,IR被认为是NAFLD发生的中心环节。研究证实,HCV可以通过激活SOCS-3和蛋白磷酸酶2A(PPA2)信号通路直接诱导IR[7,8]。HBV和HCV同属于两种常见的肝炎病毒,因此,HBV是否也具有相同的作用机制导致IR、合并CHB后肝细胞脂质合成通路有何变化,这些都已成为肝病领域研究的热点。

正常情况下,血中高浓度的脂肪酸可以刺激胰岛细胞分泌胰岛素,胰岛素通过抑制脂肪酶,从而减少外周脂肪的分解,但当存在IR时,胰岛素的抗脂降解作用减弱,导致血中脂肪酸增多。虽然NAFLD的发生机制目前尚未完全阐明,但NAFLD与IR的相关性已被大量研究证实。脂肪肝的"多重打击学说"认为第一重打击就是来自IR,它导致三酰甘油在肝脏沉积,引起单纯性脂肪变性,其次才是氧化应激、脂质过氧化等其他导致肝细胞线粒体和肝细胞本身持续损伤和炎性反应形成的"第二次打击"[3]。SOCS是一类具有抑制Janus类激酶信号转导与转录活化子信号转导通路的蛋白,其中以SOCS-3与肝脏的关系最密切。近年来研究发现,SOCS-3可以通过调整胰岛素信号转导和细胞因子信号转导,在脂肪肝的IR机制中发挥重要的作用[4]

本研究结果表明,细胞与脂变有交互作用,脂变后SOCS-3 mRNA在HepG2细胞的上调程度高于HepG2.2.15细胞,提示脂变对SOCS-3 mRNA的影响与HBV有关,HBV基因的存在可以抑制SOCS-3 mRNA的表达。据此可以推论,机体感染HBV可降低IR发生。而IR正是NAFLD发病的中心环节,这就可以解释前述中为什么HBV患者的NAFLD发病率要低于普通人群。

SREBP是一类位于内质网上的膜连接蛋白,是脂肪合成基因的主要转录调节因子,参与脂质的代谢平衡,与肝细胞三酰甘油的过度蓄积和IR的发生密切相关。目前,已发现肝脏有SREBP-la、SREBP-1c及SREBP-2 3种SREBP,其中的SREBP-1c在TG和磷脂形成中起关键作用,与脂肪酸代谢密切相关[5]。SREBP-1c高表达者,肝细胞内的脂肪酸的合成增加,而抑制SREBP-1c可以抑制脂质合成基因的下调。Lay等[9]在3T3-L1脂肪细胞的研究中证实,SREBP-1c介导胰岛素在肝脏和脂肪组织的脂肪合成作用,参与胰岛素信号通路的组成。SREBP-1c可通过下调肝脏IRS-2的转录,抑制胰岛素信号转导从而引起IR[10]。Tang等[11]研究证明,NAFLD、SREBP-1c及IR之间存在明显的关系。

关于HBV与SREBP-1c之间的关系至今国内外报道甚少,本研究结果表明,SREBP-1c mRNA在HepG2.2.15对照组表达明显低于HepG2对照组,HepG2脂变组较HepG2对照组,HepG2.2.15脂变组较HepG2.2.15对照组均出现表达上调。其中HepG2.2.15脂变组与HepG2.2.15对照组差异有统计学意义,HepG2脂变组与HepG2对照组差异无统计学意义。细胞与脂变有交互作用,提示HepG2.2.15细胞的上调能力高于HepG2细胞,HBV基因可促进脂变肝细胞SREBP-1c mRNA表达的上调,这与Kim等[12]的研究结果基本相同。

综上所述,细胞与脂变因素对SOCS-3和SREBP-1 mRNA的表达有交互作用,脂变对HepG2和HepG2.2.15细胞中SOCS-3和SREBP-1c mRNA的影响不同,HBV基因的存在,可以抑制脂变细胞SOCS-3 mRNA的表达,促进SREBP-1c mRNA的表达上调。

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关键词
主题词
肝炎,乙型
脂肪肝
细胞因子信号转导抑制物-3
固醇调节元件结合蛋白-1c